§33. Способы получения рекомбинантных дезоксирибонуклеиновых кислот

Цель изучения этой темы: объяснить способы получения рекомбинантных дезоксирибонуклеиновых кислот.

Что такое патогенные бактерии?

Что нужно повторить для успешного изучения темы? § 62 – учебник для 7 класса; § 58 – учебник для 8 класса.

  Предыстория создания рекомбинантных, или химерных, клеток и тканей. Созданию рекомбинантных ДНК предшествовал ряд фундаментальных открытий, сделавших этот процесс возможным. В первую очередь хотелось бы отметить чисто теоретические исследования, посвященные созданию химерных клеток и тканей. Первые работы в этом направлении были предприняты в конце 50-х годов ХХ в. Они не преследовали какой-либо практической цели, тем более не ставилась задача получить от подобных исследований экономический эффект.
  Как только появилось оборудование, позволявшее манипулировать с содержимым клеток, ученые начали экспериментировать. Причем эксперименты на яйцеклетках (икринках) лягушек успешно проводились в ХIХ в. Однако, когда ученые получили возможность с помощью микроигл вводить в соматические клетки чужеродные ядра, началась эпопея по созданию разных видов гибридных клеток. Были созданы клетки, в которых содержались ядра одних организмов, крупные органоиды других, а цитоплазма, мембрана и мелкие органоиды принадлежали третьим. Были созданы клетки, в ядрах которых содержались хромосомы разных существ, например кролика, ежа и мыши, черепахи и кактуса.
  Какова же была судьба этих первых «химерных» клеток? Они так никогда и не превратились в «химерные» организмы, возможно, к счастью. Сформированные благодаря экспериментальным манипуляциям культуры клеток и тканей остались по сути бесформенными кучками клеток, культивируемыми на питательных средах в условиях лабораторий в чашках Петри и пробирках. Как говорят, in vitro, что в переводе с латинского означает «в стекле». Иными словами, ученым не удалось в ходе этих экспериментов отследить, как вели бы себя гены разных организмов в едином функционирующем сложном теле. Ведь технологии получения «организма» из «культуры соматических клеток» тогда не существовало. По сути удачная методика клонирования животных, т. е. получения целого животного организма из культуры соматических клеток, до сих пор до конца не отработана. Следует понимать, что «клетки в культуре», в отличие от «свежих» соматических клеток, непосредственно извлеченных из живого организма, прошли уже некоторое, возможно, очень большое и не всегда учтенное количество делений. А через определенное количество митозов любые специализированные клетки тела теряют свою специализацию. Они вновь становятся недифференцированными, как и клетки зародыша. Механизмы их генетического «возврата» в сторону формирования специализированных клеток многоклеточного организма очень слабо изучены. Но на фоне продвижения технологий клонирования возможно в этой области будут со временем достигнуты значительные результаты. Пока же успешная на 100% методика получения целого живого организма из культуры соматических клеток отработана только для растений. Об этом речь пойдет в параграфах, посвященных клонированию организмов.
  Создание рекомбинантных ДНК началось с изучения ферментов вирусов. С их помощью внутриклеточные генетические паразиты способны «встраивать» небольшой кусочек собственной ДНК в молекулы ДНК клетки хозяина. Были обнаружены ферменты, «разрезающие» и «сшивающие» ДНК. Но этого оказалось недостаточно. Сегодня для внедрения в геном нужна частица, которая будет нести на себе нужный фрагмент ДНК и именно его «вводить» в чужую молекулу. Иначе говоря, была нужна «игла», как в шприце, благодаря которой можно сделать «инъекцию». Фрагмент молекулы, выполняющий роль инъекционной иглы, стали называть вектором.

  К слову сказать, до изобретения шприцов и капельниц, медицине приходилось проигрывать в борьбе за жизнь даже болезням, считающимся сегодня «слабыми». Так, новорожденные дети массово умирали от дизентерии из-за обезвоживания организма. Сколько бы воды ни давали больному ребенку, всасывание ее в кишечнике в кровь не происходило. Сейчас эта проблема решается внутривенным введением физиологического раствора или раствора Рингера.

  Процесс создания рекомбинантных ДНК в настоящее время включает в себя несколько обязательных этапов (рис. 34). Необходимо понимать, что порядок этих этапов может отличаться в зависимости от регламента работы лаборатории, цели исследования и т. д. Практически все этапы должны выполняться, но порядок их выполнения может существенно отличаться. Рассмотрим один из вариантов.
  1. Выявление в определенном организме-доноре гена (или группы генов), который необходимо «встроить» в ДНК другого организма-реципиента. Часто для этого могут использовать секвенирование ДНК (см. § 27).
  2. Из всей ДНК организма-донора извлекают необходимый ген (или группу генов), разрезая молекулу таким образом, чтобы получить нужный фрагмент.
  3. Иногда создаются копии выделенного гена, т. е. его клонируют. Данный процесс будет похож на стандартную репликацию.
  4. Подбирают лучший ДНК-вектор, способный не только проникнуть в клетку реципиентного организма, но и встроить донорный ген в его ДНК.
  5. «Вырезают» ДНК-вектор из всего генома организма (чаще всего вируса). Вектором может быть и плазмида (небольшая кольцевая молекула ДНК бактерий, находящаяся изолированно от основного нуклеоида). Разрезают ДНК таким образом, чтобы оставить только векторную последовательность без других вирусных или плазмидных генов.
  6. Если внедряемый ген клонировали, то клонируют и ДНК-векторы. Если же клонирование пересаживаемого гена не происходило, то и векторы также не клонируются. Чаще всего клонирование проводится, особенно если организмами-донорами являются бактерии, например используемые для производства инсулина человека.
  7. Происходит своего рода «сращивание», «встраивание» пересаживаемого от донора гена с вектором. То, что возникает в результате, уже можно назвать рекомбинантной ДНК.
  8. Подготовленный комплекс «ген – вектор» встраивается в геном клетки-реципиента. Это сложная, но хорошо отработанная процедура. Для успешности данных манипуляций используется особый температурный режим (прогревание), добавление реактивов. Часто они содержат микроэлементы, ферменты и вещества – регуляторы роста и генной активности.

Рис. 34. Процесс создания рекомбинантных ДНК

  1 – «вектор» – в данном случае бактериальная плазмида; 1А – целая, только что извлеченная из клетки;
  2 – ген (вероятно, результат мутации), обеспечивающий данному штамму бактерий устойчивость к антибиотикам;
  3 – фрагмент ДНК, содержащий необходимый для встраивания ген (например, инсулина человека), который необходимо встроить в другую клетку (например, бактериальную).
  4 – «сайты рестрикции» – «вырезание» с помощью ферментов необходимого донорного гена.
  5 – донорный ген; 5а – «липкие концы» молекулы ДНК.
  1Б – «разрезанная» с помощью ферментов плазмида, готовая к «вшиванию» донорного гена; б – ее «липкие концы».
  6 – плазмида – вектор с встроенным донорным геном; В – ее помещают в среду с немодифицированными бактериями;
  7 – бактериальные клетки; Г – собственная кольцевая ДНК бактерий;
  8 – генно-модифицированная бактерия, которая уже «заразилась» плазмидой-вектором.
После этого культуру клеток обрабатывают антибиотиком и все немодифицированные бактерии (7) погибают, так как не имеют содержавшегося в плазмидах гена устойчивости;
  9 – две дочерние генно-модифицированные клетки – результат первого деления исходной материнской клетки, получившей плазмиду;
  10 – четыре дочерние генно-модифицированные клетки – результат второго деления двух клеток первого поколения. Многочисленные последующие деления клеточной культуры на схеме не отражены.

  Полученные клетки со встроенным чужеродным геном называются трансгенными, а весь процесс внедрения фрагмента донорской ДНК – трансформацией.
  На всех этапах манипуляции с генами используются ферменты. Речь о них в целом и о каждом в отдельности пойдет в следующих параграфах этого раздела (см. § 39).

  Химерные клетки, вектор, донорный ген, трансгенные клетки, трансформация.

Знание и понимание
1. Что такое химерные клетки и ткани? Почему их создание и исследование считаются первым пунктом на пути к созданию рекомбинантных ДНК?
2. Определите связь между ДНК-вектором и процессом рекомбинации.

Применение
1. Для чего необходимо изучать генетические механизмы вирусов? Как это связано с генетической рекомбинацией?
2. Назовите причины, по которым ученым удалось получить рекомбинантные ДНК. Какие открытия легли в основу этих манипуляций?

Анализ
1. Изобразите в виде схемы этапы генной трансформации организмов.
2. Проанализируйте этапы генной трансформации. Какие из этапов будут обязательными, а какие можно опустить? Можно ли начать процесс с этапа № 4? Какой порядок действий вы предложите в этом случае?

Синтез
Порассуждайте, могли бы все генно-модифицированные организмы называться трансгенными? Какое из выражений будет безупречно верным?
1) Все генно-модифицированные организмы будут трансгенными, но не все трансгенные будут генно-модифицированными.
2) Все трансгенные организмы будут генно-модифицированными, но не все генно-модифицированные будут трансгенными.

Оценка
1. Напишите реферат о применении рекомбинантных ДНК и трансгенных организмов.
2. Обсудите следующие высказывания:
– Наука не создает ничего принципиально нового. Она лишь «подсматривает» за тайнами природы и берет их себе в услужение.
– Нас (человечество) ожидает бесспорный триумф рекомбинантных ДНК.


×
×

Корзина