§36. Способы клонирования организмов растений
Цель изучения этой темы: объяснить способы клонирования организмов растений.
Что такое культура клеток и тканей? Что такое меристемы? В результате чего от пня срубленного дерева начинают расти молодые побеги – поросль? Что вы помните о раневых меристемах и спящих почках?
Что нужно повторить для успешного изучения темы? § 62 – учебник для 7 класса; § 58 – учебник для 8 класса.
Особенности растений как объектов клонирования. В качестве объектов клонирования более всего подходят растения. Как вы уже поняли, клонировать растения можно традиционным способом, размножая их вегетативно. Именно поэтому организмы растений легко поддаются современным методам клонирования через выращивание целого растительного организма из культуры клеток и тканей. Дело в том, что в телах растений всегда сохраняется некоторое количество клеток образовательной ткани, которые, являясь клетками тела (соматическими), функционально похожи на клетки зародыша. Это так называемые меристемы. Причем меристематические клетки не только обладают высокой способностью к размножению, их генетическая программа не исключает дифференциацию в разнообразные утраченные ткани и органы.
Наверняка вам приходилось видеть, как на пне взрослого спиленного дерева начинают пробиваться молодые побеги – поросль. Ведь если бы взрослое дерево не спилили, а дали ему дожить до старости и умереть естественной смертью, то никакие молодые ветви в основании старого ствола не появились бы. Так откуда они взялись? В организме растений сохраняются так называемые придаточные почки, раневые меристемы и другие элементы, состоящие из клеток, потенциально способных образовывать новые части растений взамен утраченных.
Методы клеточной инженерии связаны с культивированием отдельных клеток в питательных средах. Оказалось, что клетки растений и животных, помещенные в питательную среду, содержащую все необходимые для жизнедеятельности вещества, способны быстро и хорошо делиться. Клетки растений и животных обладают свойством тотипотентности – способности синтезировать все белки, необходимые для жизнедеятельности. Однако именно клетки растений, в отличие от животных, обладают высокой тотипотентностью, т. е. при определенных условиях они способны развиться до полноценного растения.
Рассмотрим разные способы выращивания клонированных растений методами биотехнологии.
Микрочеренкование как выращивание растений из почек. Существует несколько широко распространенных методов, когда в стерильных лабораторных условиях, с использованием специального оборудования, питательных сред, антибиотиков, факторов роста (фитогормонов) и т. п. ученые получают микрочеренки из образовавшихся почек. В этой методике нет стадии культуры клеток (массы клеток, полученных при размножении вне организма растения in vitro). По сути этот способ клонирования почти не отличается от обычного вегетативного размножения. Фактически это традиционный процесс разделения организма растений на части, только с применением более качественных лабораторных условий и манипуляций. Чаще всего используют фрагменты молодых побегов (стеблей), содержащие как минимум одну почку, из которой и разовьется молодое растение. Нам не хотелось бы рассматривать этот метод подробнее, так как он является наиболее архаичным, хотя и усовершенствованным по сравнению с технологиями, которыми люди пользовались еще с доисторических времен.
Получение каллуса. Это один из современных и часто используемых методов клонирования растений. Для этого берут, например, клубни картофеля с растущими «глазками». Отделяют этот зачаточный побег. Проводят его стерилизацию. Вообще стерильность – одно из важнейших условий, обязательно соблюдаемое при клонировании растений. Для этого используют спирт, хлорсодержащие препараты, щелочи и другие дезинфицирующие средства.
Сейчас уже в совершенстве отработаны методики дезинфекции тех частей растения, из которых будут извлекать клетки для процесса клонирования. Причем это не обязательно вегетативные органы. В практике используются также семена, из которых извлекают зародышевые клетки. Хотя это не вполне подходит под классическое определение клонирования. Однако такая формальность не мешает ученым использовать клетки генеративных органов растений и их зародышей для получения наилучших сортов.
Из стерильного побега в специальном устройстве с использованием микроскопа специальными микроиглами срезают необходимые клетки. Это могут быть клетки изолированной верхушечной меристемы, так называемый конус нарастания, либо клетки меристемы между зачаточными листьями. Ученые заметили потрясающий факт: клетки, взятые из почечных меристем, не содержат вирусов. Полученные из таких клеток растения тоже будут полностью безвирусными. Этапы и варианты клонирования растения показаны на рис. 37.
Неверно думать, что для культуры клеток используются только меристематические клетки. Существует хорошо отработанная технология клонирования клеток корнеплода моркови. Морковь дезинфицируют, разрезают вдоль, разделяют на крупные сегменты, которые затем повторно дезинфицируют, вырезают более мелкие сегменты и сажают их на питательные среды. Все манипуляции проводят в стерильных условиях.
После извлечения из растения выбранные клетки переносятся на питательную среду и выращиваются в стерильных условиях. В этой среде есть не только все необходимые вещества и микроэлементы, но и стимулирующие фитогормоны. Важнейшими фитогормонами в этом производстве являются ауксин и цитокинин. Например, для картофеля на первых этапах выращивания используют синтетический цитокинин.
Фитогормоны применяются в этих манипуляциях постоянно. Так, например, для процедуры «выгона» почки применяют смеси из цитокининов и ауксинов в разных соотношениях (от 10:1 до 100:1 в зависимости от использованного материала). Что такое «выгон» почки? В лабораторных условиях любой орган растения заставляют давать листики, стебелечки, побег и, соответственно, со временем целое растение. Экспериментально доказано, что из изолированного зародыша, стебля, листа, части корня, донца любых луковиц или из их чешуй, семядолей и даже зачаточных соцветий, находящихся в бутоне генеративной почки, можно получить побеги с почками.
Рис. 37. Клонирование растений
I – клонирование растения из ткани корнеплода моркови;
II – клонирование растения из безвирусных меристематических клеток верхушечной почки;
а – забор клеточного материала (в стерильных условиях, исключая попадание иных микроорганизмов);
б – помещение отобранных клеток на питательную среду (все необходимые витамины, микроэлементы, стимуляторы роста);
в – рост массы клеток – получение каллуса (когда масса клеток станет достаточной, она подвергнется обработке фитогормонами);
г – «выгон» из каллуса целого организма растения. Это результат действия фитогормонов и зачастую выдерживание определенного температурного режима, режима освещенности, изменения состава питательных сред.
У растения II клетки точно будут безвирусными, у растения I – это не гарантировано.
Очень важны условия, в которых выращивается культура клеток: поддерживается постоянная температура (чаще всего 25°С, ±2°С), влажность воздуха 70%, освещенность 5 люкс (Lx), 16 ч в сутки. Конечно, все эти условия могут несколько отличаться у разных клеточных культур в зависимости от вида растений и конечной цели. В данном случае мы приводим показатели условий для выращивания картофеля. Они же являются широко распространенными и часто применяемыми.
В среднем с момента помещения клеток на питательную среду до появления проростков с 5–6 листочками проходит 30–45 дней. Вначале клетки просто начинают размножаться на питательной среде. Образуется так называемый каллус – группа недифференцированных клеток (клеточная каша). Каллус образуется не только в условиях лаборатории. Он может образоваться в местах повреждения растений как временная ткань для заживления. Возможно вам приходилось видеть, как у крупных взрослых деревьев вокруг обломленных ветвей образуется сероватая бесформенная масса, по текстуре похожая на рыхлую манную кашу. Это каллус.
Именно из каллуса образуются новые почки, из которых разовьется побег. Для некоторых растений процесс выхода почки может длиться до 8 месяцев. У некоторых видов почки никогда сами не образуются из каллуса и их необходимо стимулировать активными веществами (фитогормонами или другими). Понятно, что за столь длительное время питательная среда истощается. Поэтому по мере необходимости производят пересадку клеточных культур на новые питательные среды или вносят в среду недостающие вещества. При этом также соблюдается стерильность. Питательные среды могут быть жидкими или гелеобразными на основе агар-агара.
Объект клонирования, клеточная инженерия, тотипотентность, каллус, микрочеренкование.
Знание и понимание
1. Объясните, почему важно проводить клонирование растений.
2. Опишите все виды клонирования, применяемые для растений. Каковы их особенности?
Применение
1. Сравните, чем клоны растений, созданные искусственным путем через культуры клеток, отличаются от естественных клонов, созданных путем вегетативного размножения.
2. Назовите причины, по которым применение генеративных и зародышевых клеток при клонировании растений не считается клонированием в полной мере.
Анализ
1. Изобразите в виде схемы и опишите все этапы и условия выращивания любых растений с использованием каллуса.
2. Ученые выяснили, что взятые из меристемы почки клетки не содержат вирусов. Из них могут вырасти растения, которые также не будут содержать в клетках вирусные частицы. Какие выводы можно сделать, проанализировав этот факт?
Синтез
1. Порассуждайте, почему при помещении любых клеток растений в питательную среду они способны вырасти в самостоятельный организм. Почему это не происходит с клетками животных?
2. Порассуждайте, совершили ли люди прорыв в клонировании, когда смогли клонировать растительные организмы. Ответ обоснуйте.
Оценка
1. Обсудите и оцените селекционные, экономические и иные последствия применения клонирования растений, зная следующий факт.
Из ограниченного числа исходных меристемных растений за несколько месяцев можно получить большое количество безвирусного посадочного материала (за полгода – 30 000). При этом за каждый цикл черенкования оно возрастает в 4–5 раз. По мнению многих исследователей, способы размножения на основе снятия апикального доминирования – удаления верхушечной почки, в результате которого происходит интенсивное формирование боковых почек (побегов), имеют минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота появления мутантных форм (в расчете на число новых организмов) здесь не превышает частоту появления таковых при размножении растений обычными вегетативными методами.
Данный способ получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высокой воспроизводимостью полученных результатов (количество генетически однородных потомков).