§27. Секвенирование геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты человека
Цель изучения этой темы: обсудить значение международного проекта «Геном человека».
Как называется основной фермент репликации?
Тақырыпты табысты меңгеру үшін § 7 – учебник для 10 класса.
Базовые генетические понятия. Как вы помните, единицами наследственности и изменчивости являются гены. Ген – это участок молекулы ДНК, кодирующий первичную структуру белка (полипептида), тРНК или рРНК.
Этапы развития генетики связаны с именами таких известных ученых, как Г. Мендель, Т. Морган, Ф. Крик, Дж. Уотсон и ряд других.
В последующих исследованиях передовым достижением стала разработка методов анализа первичной структуры ДНК, т. е. последовательности нуклеотидов в ней. Эти открытия и возникшие методы послужили началом становления нового научного направления – геномики. Одним из определяющих методик изучения структуры ДНК является секвенирование.
Что такое секвенирование? Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. Секвенирование ДНК – прочтение нуклеотидной последовательности первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который работал бы для молекулы ДНК целиком. Все они устроены так: сначала готовится большое число копий фрагментов ДНК (они многократно клонируются и в случайных местах «разрезаются»), затем читается каждый участок по отдельности. Клонирование проводится либо выращиванием клеток в чашке Петри, либо с помощью метода ПЦР – полимеразной цепной реакции (в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы).
В самом обобщенном виде работу этого метода можно представить в виде следующих этапов:
1. Сначала ДНК денатурируется, т. е. разрушаются водородные связи и получаются отдельные нити.
2. Затем к нитям ДНК присоединяют так называемые праймеры. Это короткие участки ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза. Как вы помните, это основной фермент репликации. Именно он и будет заниматься собственно копированием нитей ДНК.
3. На следующем этапе полимераза копирует фрагмент ДНК, после чего процесс можно многократно повторять: для каждого цикла отдельных нитей будет уже вдвое больше.
Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы. Для достижения целей исследования важно, что это достаточно точный процесс и ошибки в нем редки, а на выходе получается большое число копий – участков одной и той же ДНК. Другими словами, с помощью ПЦР получают большое (какое только необходимо) число копий коротких фрагментов исследуемой ДНК (рис. 23).
Важным подспорьем в ускорении секвенирования стало открытие полимеразной цепной реакции. В 1993 г. Нобелевская премия по химии была присуждена К. Муллису за метод амплификации (умножения) ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.
Рис. 23. Секвенирование фрагмента ДНК
I – фрагмент одной цепи молекулы ДНК, который будет подвергаться секвенированию – расшифровке нуклеотидной последовательности;
II – выбранный фрагмент ДНК многократно реплицируется, создается большое количество его копий, чтобы быть подвергнутым последующему анализу – ПЦР. Процесс происходит in vitro (в лабораторной посуде) в среде, содержащей ферменты репликации (ДНК-полимеразу) и готовые нуклеотиды (с изотопными метками, обогащенные энергией). Этапы репликации схематично изображены от а (реплицированный фрагмент состоит из 6 нуклеотидов) до г (фрагмент состоит из 14 нуклеотидов);
III – расшифровка последовательности нуклеотидов в анализируемом фрагменте ДНК с помощью хроматографии на геле методом электрофореза. Полоски отражают реальную последовательность нуклеотидов в ДНК.
Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методикой клонирования ДНК (с помощью ПЦР или иным способом), а тем, как потом прочесть получившуюся «смесь» из многочисленных копий одного и того же фрагмента ДНК.
Наука не стоит на месте, методы секвенирования постоянно улучшаются. Практически все современные методы выдают относительно короткие «читаемые» фрагменты: всего от 100 до 400 нуклеотидов. Кроме того, современные секвенаторы гораздо дешевле. Так, например, проект по полному «прочтению» первого человеческого генома, завершенный в 2008 г., занял 13 лет и стоил 3,8 млрд долларов. Новые технологии секвенирования обещают научиться обрабатывать полный геном одного человека за 1000 долларов и даже меньше, что открывает возможности для массового секвенирования в медицинских целях.
Геномика, секвенирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Знание и понимание
1. Что такое секвенирование?
2. Определите связь между ПЦР и секвенированием.
Применение
1. Для чего изобретают и применяют методы секвенирования?
2. Назовите причины, по которым необходимо вести исследования в данном направлении.
Анализ
1. Изобразите в виде схемы взаимосвязь методов секвенирования и ПЦР-анализа. Какой из них является этапом для другого?
2. Проанализируйте этапы ПЦР-анализа. Сравните их с этапами репликации в интерфазе.
Синтез
1. Порассуждайте, как могли бы развиваться дальнейшие методы секвенирования.
2. Смоделируйте ситуацию: «В ближайшем будущем секвенирование станет таким же обыденным методом исследования, как общий анализ крови». К каким экономическим, социальным и этическим последствиям может привести широкое применение этого метода?
Оценка
1. Напишите реферат о применении секвенирования и ПЦР-анализа.
2. Обсудите и оцените следующее мнение: «Секвенирование не панацея и даже не претензия на панацею. Это всего лишь еще один диагностический метод, как термометр или тонометр. Само по себе секвенирование ничего не изменит ни в фармакологии, ни в терапии, а только лишь в диагностике наследственных заболеваний».